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?中瑞祥解析活性氧测定仪的使用步骤

活性氧测定仪 使用原理?主要基于荧光探针 DCFH-DA （2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯）的氧化反应。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞后被细胞内的酯酶水解生成DCFH（2',7'-二氯二氢荧光素）。DCFH不能通透细胞膜，从而被细胞内的活性氧（ROS）氧化生成有绿色荧光的DCF（二氯荧光素）。DCF的荧光强度与细胞内ROS的水平成正比，因此可以通过检测DCF的荧光强度来定量测定细胞内的ROS水平?

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活性氧测定仪的使用步骤

?装载探针?：对于刺激时间较短的细胞（通常为2小时内），先装载探针后再进行刺激；对于刺激时间较长的细胞（通常为6小时以上），先进行刺激后再装载探针。

?细胞准备?：检测前一天进行细胞铺板，确保检测时细胞数量小于5×10^5/mL。

?药物诱导?：去除细胞培养液，加入无血清培养基稀释的药物处理，于37℃细胞培养箱内避光孵育，实际诱导时间由药物特性和细胞类型决定。

?阳性对照?：可选步骤，先用无血清培养基稀释阳性对照（如Rosup）到常用工作浓度，加入细胞中孵育30分钟至4小时，以提高活性氧水平。

?探针装载?：吸除处理药物，加入稀释好的DCFH-DA工作液，37℃细胞培养箱内避光孵育30分钟。

?细胞清洗?：用无血清培养液洗涤细胞1-2次，以去除未进入细胞的DCFH-DA。

?荧光检测?：使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪等设备，在激发波长502 nm、发射波长530 nm附近检测DCF的荧光强度?

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活性氧测定仪的应用领域和重要性

活性氧（ROS）在细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡等生理和病理过程中起着重要作用。通过测定细胞内的ROS水平，可以了解细胞在不同条件下的氧化应激状态，对于研究疾病机制、药物毒性评估以及开发新的治疗方法具有重要意义。此外，活性氧测定仪还广泛应用于生物医学研究、环境监测和食品安全等领域?